Lentivirus vectors fail to deliver transgenes into bovine zygotes after co-incubation with sperm during in vitro fertilization / [Lentivírus falham na entrega de transgenes em zigotos bovinos após coincubação com espermatozoide, durante fertilização in vitro]

As vantagens dos animais transgênicos têm sido demonstradas em diferentes aplicações, entretanto muitas metodologias usadas para gerar animais geneticamente modificados (GM) apresentam baixas taxas de eficiência. O objetivo deste estudo foi avaliar a entrega dos vetores lentivirais (VLs) em zigotos durante a fertilização in vitro (FIV), para gerar embriões GM, com o gene da proteína verde fluorescente (GFP) ou do fator IX de coagulação humana (FIX). Vetores lentivirais com os genes GFP (pLGW-GFP-LV) ou FIX (pLWE2-FIX-LV) foram utilizados na FIV ou na cultura de embriões in vitro (CIV). A coincubação de pLWE2-FIX-LV com espermatozoides e complexos oócitos-células do cumulus (COCs) durante a FIV diminuiu (P<0,05) as taxas de clivagem e de blastocistos, enquanto com pLGW-GFP-LV diminuiu (P<0,05) a taxa de blastocisto quando se comparou ao controle sem VL. A coincubação de pLWE2-FIX-LV e pLGW-GFP-LV com presumíveis zigotos durante a CIV não afetou (P>0,05) o desenvolvimento embrionário. A expressão da proteína GFP não foi detectada em embriões após a coincubação de FIV ou CIV, embora as células do cumulus expressassem a proteína até o dia oito de cultivo in vitro. Reações em cadeia da polimerase (PCR) não detectaram os genes GFP ou FIX em embriões, mas ambos foram detectados em células do cumulus. Assim, a coincubação de VL com espermatozoide bovino e COCs não é eficaz para produzir embriões geneticamente modificados por meio de FIV.(AU)

Quantificação do DNA e genotipagem de biópsias de embriões bovinos Gir e Girolando produzidos in vitro / DNA quantification and genotyping of biopsies obtained from Gyr and Girolando in vitro produced bovine embryos

A biópsia embrionária associada à genotipagem permite a obtenção de informações genômicas antes mesmo da transferência dos embriões. Neste estudo, foram avaliadas amostras biopsiadas de blastocistos bovinos transferidos para receptoras (n=47), sob a hipótese de que a raça (Gir ou Girolando), o estádio embrionário (blastocisto ou blastocisto expandido) e a competência para estabelecimento de prenhez (positiva ou negativa) afetariam a quantidade e a qualidade do DNA da amostra obtida. O DNA foi extraído, amplificado, quantificado por eletroferograma e genotipado. O parâmetro call rate (CR) foi adotado para mensurar a qualidade da genotipagem. Obteve-se concentração de DNA de 86,07±171,66ng/µL e CR 0,73±0,17. O CR não variou em função da quantidade de DNA nas amostras. As variáveis raça e estádio embrionário não influenciaram a concentração de DNA, nem o CR. Houve efeito da prenhez sobre o CR (P=0,0187), mas, como houve maior CR nas amostras provenientes do grupo prenhez negativa, não foi possível associar esse parâmetro à qualidade embrionária. Concluiu-se que a raça e a qualidade embrionária não afetam os parâmetros aqui estudados em amostras embrionárias, ou seja, embriões com maiores chances de implantação não refletem alta qualidade nas amostras de biópsia genotipadas.(AU)

Embryo biopsy associated with genotyping allows genomic information before embryo transfer. In this study, blastocyst biopsy samples from embryos transferred to recipients (n= 47) were evaluated, under the hypothesis that breed (Gyr or Girolando), embryonic stage (blastocyst or expanded blastocyst) and competence to establish pregnancy (positive or negative) would affect the quantity and DNA quality of samples. DNA was extracted, amplified, quantified by electropherogram and genotyped. The parameter call rate (CR) was used to measure the quality of genotyping. DNA concentration of 86.07±171.66ng/µl, and CR 0.73±0.17 was obtained. CR did not vary according to the amount of DNA in the samples. The variables breed and embryonic stage had no influence on DNA concentration or CR. There was pregnancy effect on the CR (P= 0.0187), but since there was a higher CR in the samples from the negative pregnancy group, it was not possible to associate this parameter with the embryonic quality. We conclude that the breed and embryo quality do not affect the evaluated parameters in embryonic samples. Embryos with higher chances of implantation do not reflect high quality in embryo biopsy genotyped samples.(AU)